脑缺血再灌注相关的免疫细胞和细胞因子

李力仙：不同的组织器官由于结构和功能上的差别，缺血和再灌注损伤时的表现及损伤特点也有所不同。脑组织的活动主要依靠葡萄糖的有氧氧化提供能量，它是一个对缺氧最敏感的器官，一旦脑缺血达到一定程度，再灌注不仅不能使缺血区的代谢和机能得以恢复，反而能加重脑水肿、扩大脑梗塞灶，此种损伤作用称为脑缺血再灌注损伤。因此Siosjǒ[1]称脑缺血后再灌注为一把双刃利剑，它既能挽救频临梗死的细胞，又可加重缺血细胞的损伤。以往对脑缺血再灌注损伤机制的研究主要集中于自由基、兴奋性氨基酸的释放及细胞内钙超载等方面，而较少涉及免疫系统的作用，因以前认为：（1）中枢神经系统（CNS）内缺乏淋巴管系统；（2）CNS内主要组织相容性复合体(MHC)Ⅰ型和Ⅱ型抗原表达水平低；（3）血脑屏障构成了循环血细胞进入CNS的障碍[2]。近年来的研究发现CNS和免疫系统间存在特有的解剖关系，血脑屏障的选择通透性可以使一些免疫活性细胞穿越血脑屏障到达脑内，将免疫信息传递给CNS，血脑屏障的选择通透性对CNS细胞微环境中的免疫细胞和免疫因子具有调节作用，研究证实CNS具有与其它器官系统相同的抗原呈递、抗体产生、细胞因子合成和细胞吞噬过程[3]。很多证据表明脑缺血再灌注后脑组织局部过度的炎症反应是造成再灌注损伤的主要原因之一，免疫机制，尤其是免疫细胞和细胞因子在脑缺血再灌注损伤中的作用越来越受到重视，现综述如下：

一、与脑缺血再灌注损伤有关的免疫细胞

1、星形胶质细胞

星形胶质细胞在脑内数量最多，与神经元之比是10：1。星形胶质细胞与神经元的关系十分密切，除物理支持、生化代谢和绝缘作用外，抗原呈递和分泌细胞因子也是很重要的方面。它能表达MHCⅠ类和Ⅱ类抗原、ICAM-1[4]、IL-1β[5]、TNF-α、IL-6[6]等参与缺血再灌注后的炎症反应。

2．小胶质细胞

小胶质细胞数量相对较少，约占胶质细胞总数的11%。与CNS内的其它类型细胞不同，现在通常认为小胶质细胞起源于单核吞噬细胞系统，在血脑屏障发育成熟前进入CNS，是CNS的巨噬细胞。脑缺血或缺血再灌注后小胶质细胞迅速激活[7]，小胶质细胞激活后开始增殖并在损伤部位聚集，促进几种表面分子的表达，包括MHCⅠ类和Ⅱ类抗原、APP以及IL－1β、TGF－β1等细胞因子。在超微结构方面，小胶质细胞转化成吞噬细胞除去坏死的神经元，但能保持存活神经元的完整性。就功能而言，小胶质细胞的激活具有双重作用：一方面，激活的小胶质细胞可以发挥细胞毒性作用，释放活性氧自由基、一氧化氮、蛋白酶和炎性细胞因子等[8]，用药物抑止小胶质细胞的激活可以明显减轻细胞死亡和组织损伤的范围；另一方面，激活的小胶质细胞可通过分泌因子来促进组织修复，如TGF－β1可抑止组织损伤，同时限制星形胶质细胞瘢痕的形成[9]。

3、白细胞（本文指中性粒细胞和单核巨噬细胞）

Garcia等[10]报道白细胞于缺血后30分钟即可进入脑组织；Barone等[11]发现脑缺血后再灌注实际上增加了进入缺血鼠脑的中性粒细胞的数量：在持续性大脑中动脉闭塞24小时后，每克鼠脑中含有约60万个中性粒细胞；在大脑中动脉闭塞3小时，再灌注21小时后每克鼠脑内有近2百万个中性粒细胞。Mackay等[12]用线栓法大鼠脑缺血再灌注病理模型观察NIF对再灌注损伤的影响：他们于缺血2小时后再灌注，于再灌注开始后即刻、2小时、4小时分别给予NIF（1.5mg/kg.IV），发现NIF能明显减少缺血半球的脑梗塞体积、脑水肿及神经病学症状。许多研究表明抑止白细胞功能对单纯缺血性脑损伤没有影响，却能有效减少缺血再灌注损伤[13]。越来越多的证据表明白细胞在脑缺血再灌后的继发性损伤中发挥关键性的作用[14]。白细胞对缺血再灌注脑组织的损伤作用包括以下几个方面：（1）影响微循环 del Zoppo等[15]发现狒狒大脑中动脉闭塞3小时，再灌注1小时后，4.7%的微血管被白细胞完全阻塞；3.5%的微血管被部分阻塞。（2）破坏血脑屏障，加重脑水肿 粘附聚集于微血管内的白细胞能释放自由基、蛋白水解酶及其它有害物质，损害血管壁，增加血管通透性，破坏血脑屏障。（3）直接损害神经元及胶质细胞 大量的白细胞在局部微血管内聚集后浸润到脑组织中，释放溶酶体酶，使组织蛋白水解破坏，产生自由基和不饱和脂肪酸引发脂质过氧化反应，破坏细胞膜的结构和功能。浸润到脑组织内的中性粒细胞和巨噬细胞还能分泌细胞因子如IL-1β、TNF-α、IL-8、MIP-1等，这表明：一旦白细胞到达炎症部位后，就可以募集更多的白细胞，并促进中性粒细胞、单核/巨噬细胞和淋巴细胞的激活[16、17]。

二、与脑缺血再灌注有关的细胞因子。

细胞因子是指由活化的免疫细胞和某些基质细胞分泌的，介导和调节免疫、炎症反应的小分子多肽，是除免疫球蛋白和补体外的另一类非特异性免疫效应物质。按细胞因子在炎症反应过程中的作用可将其分为促炎细胞因子和抗炎细胞因子。

（一）促炎细胞因子

1、TNF-α

TNF-α是一种多功能的细胞因子，脑缺血再灌注损伤后可由小胶质细胞、星形胶质细胞、神经元、血管内皮细胞和侵入的中性粒细胞、巨噬细胞分泌[18]。Liu等[19]发现大鼠局灶性脑缺血后3～6小时神经元表达TNF-α，12小时后出现中性粒细胞浸润；给大鼠脑皮质注射TNF-α后，24小时内局部毛细血管中大量白细胞附壁（多为中性粒细胞），很多已侵入内皮下层，提示TNF-α可诱导炎性细胞在急性期进入缺血损伤的脑组织。Barone等[20]证实大鼠脑缺血前24小时腹腔注射TNF-α可明显加重缺血损伤；缺血前0.5小时及缺血后3～6小时内注射TNF-α单克隆抗体或可溶性TNF-αⅠ型受体，均能减轻脑损伤。最近Lavine等[21]发现大鼠局灶脑缺血再灌注的早期TNF-α迅速而短暂地释放入血，而血中的TNF-α抗体可保护脑组织免受再灌损伤。从上述结果可以看出TNF-α在脑缺血再灌注损伤中起重要作用。

研究表明TNF-α可能是通过下述方式参与脑损伤的：（1）激活PLA2 TNF-α能激活脑内的PLA2[22－24] 。脑组织含有大量磷脂成分，而PLA2是水解细胞膜磷脂的关键酶。神经细胞膜磷脂的水解可使细胞发生结构与功能的改变，由此导致细胞的破坏，同时释放大量的AA。AA在脂氧酶作用下合成白三烯，增加血脑屏障的通透性。AA在环加氧酶、过氧化酶和血栓素合成酶的作用下合成（TXA2，它是目前所知体内合成的最强烈的血管收缩物质，较血管紧张素Ⅱ的血管收缩效应强100倍，可造成血管损伤和血流供给障碍。AA在代谢的过程中可产生大量的氧自由基。PLA2还可催化PAF的生成。氧自由基和PAF均能造成脑组织的严重损伤；（2）激活中性粒细胞和巨噬细胞 TNF－α对中性粒细胞和单核细胞有趋化作用[25]，诱导中性粒细胞和巨噬细胞“呼吸爆发”，产生大量有害物质；（3）对脑血管内皮细胞的作用 TNF-α可刺激VEC合成和表达IL-1、IL-8、ICAM-1、ELAM-1和凝血因子Ⅷ[26、27]；促进白细胞与内皮细胞的粘附；一方面，抑止C蛋白通路即VEC表面的抗凝作用；另一方面，使内皮细胞产生组织因子样活性，导致血管口径变小，血管内血栓形成，造成血流量不同程度减少。TNF-α能诱导VEC合成PAF。PAF和IL-8均可趋化中性粒细胞损伤VEC，导致血管通透性增加。体外实验证实：培养的VEC经TNF-α处理后，其形态发生明显改变，细胞重叠，肌动蛋白丝重新排列，纤维蛋白连接丢失；高浓度的TNF-α能抑止VEC增殖，甚至杀伤VEC；（4）TNF-α与其他细胞因子的相互作用 TNF-α并非单独发挥作用而是与其它细胞因子彼此形成相互作用的信号网络：TNF-α能诱导IL-1、IL-8、单核细胞趋化因子和PAF等炎性细胞因子的合成释放，并通过这些介质影响几乎所有的免疫细胞、内皮细胞和成纤维细胞参与炎症反应和组织损伤[28]；（5）增强脑内β受体活性 TNF-α能增强肾上腺素能β受体的活性。肾上腺素能β受体是启动能量代谢的重要途径之一，β受体同腺苷酸结合蛋白－腺苷酸环化酶相偶联，介导细胞内cAMP浓度上升，激活cAMP依赖的蛋白激酶C，导致一系列代谢活动的变化，最终促进脑内高能量代谢状态，造成乳酸在脑内的积聚，产生酸中毒。酸中毒能促进钠离子进入神经胶质细胞和神经元，引起渗透性水肿；（6）通过影响物质代谢、介导多器官衰竭和发热等作用加重脑损伤。

近年来的研究也证明TNF-α具有神经保护作用。Cheng等[29]发现TNF-α能保护培养的胎鼠海马皮层和间隔的神经元对抗兴奋性氨基酸的毒性作用和葡萄糖缺乏引起的损伤。Bruce等[30]发现TNF受体基因敲除小鼠脑缺血后神经损伤明显加重，脑细胞抗氧化酶减少，表明TNF-α可能在脑缺血的某些阶段参与抗氧化机制。可见，TNF-α在脑缺血再灌注损伤后也表现出多种保护性作用，但具体机制尚不明确。

2、IL-1β

IL-1β是一种分子量为17KD的多肽，脑缺血再灌注损伤后星形胶质细胞、少突胶质细胞、小胶质细胞、神经元、血管内皮细胞以及浸润的巨噬细胞可以分泌IL-1β[31]。许多研究表明脑缺血再灌注后IL-1βmRNA表达迅速升高。Minami等[5、32]用Northern blot方法发现大鼠前脑缺血15分钟及再灌注15分钟～4小时IL-1βmRNA表达明显增加，随后用原位杂交技术发现再灌注30分钟后胶质细胞和血管周围细胞表达IL-1βmRNA。Wang等[33]观察到自发性高血压大鼠大脑中动脉闭塞60分钟，再灌注1小时，IL-1βmRNA开始表达，6小时达高峰，48小时表达下降。在全脑缺血30分钟，再灌注3～7天内原位杂交未发现IL-1β表达[34]。Saito等[35]发现沙土鼠全脑缺血10分钟，再灌注3～6小时IL-1β蛋白水平升高（ELISA法）。脑缺血再灌注后脑内IL-1βmRNA表达和蛋白含量增加表明缺血再灌注可诱导IL-1β合成。脑室内注射低剂量IL-1β（5～10ng）即能加重大鼠缺血性脑损伤，增加梗塞面积、脑水含量和脑实质内浸润的白细胞数量；使用IL-1β抗体、IL-1阻断剂ZnPP、IL-1受体拮抗剂（IL-1ra）均能减轻脑缺血再灌注后脑梗塞的体积，炎症反应和脑水肿的程度[5、31、36-38]，提示IL-1β在脑缺血再灌注损伤中发挥重要作用。IL-1β可能是通过下述机制发挥损伤作用的：（1）促进炎症反应 脑缺血再灌注后，IL-1β的释放能诱导血管内皮细胞表达粘附分子，促进脑实质内白细胞的浸润，浸润的白细胞释放的炎症介质能加重炎症反应。其次IL-1β促进不同的细胞合成炎性细胞因子IL-8、TNF-α、克隆刺激因子和IL-1β自身。IL-1β促炎作用的另一重要环节是激活脑内的小胶质细胞。小胶质细胞被认为是脑内的巨噬细胞，激活的小胶质细胞通过多种途径参加脑内炎症反应[39]；（2）促进自由基的释放 自由基被认为是脑缺血损伤的重要介质。IL-1β能促进全民健康网四烯酸的代谢，在全民健康网四烯酸代谢成前列腺素和白三烯的过程中可生成氧自由基；同时IL-1β能促进一氧化氮的合成[40]。氧自由基和一氧化氮均可引起脑损伤[39]；（3）增强兴奋性氨基酸的作用 IL-1ra能减轻兴奋性氨基酸引起的神经元损伤，提示内源性IL-1直接或间接增强兴奋性氨基酸的脑损伤作用。体外研究发现IL-1β能抑止离体海马脑片NMDA受体介导的长效动作电位[41]。目前有关IL-1β影响兴奋性氨基酸释放、再摄取作用的具体环节和机制尚不清楚；（4）参与发热反应 IL-1β是一种内源性致热原，其引起的发热作用与IL-1RⅡ有关。研究发现脑温升高能明显加重脑缺血再灌注损伤的程度[42]；（5）降低脑血流量 IL-1β是白细胞的趋化因子，此外它还能诱导脑血管内皮细胞合成ICAM-1、E-selectin等粘附分子[43]，使白细胞积聚于微血管内；另一方面，IL-1β诱导内皮细胞促凝血因子的产生，抑止抗凝血因子的活性，促进血管内血栓的形成，减少梗塞周边区血流。

脑室内注射IL-1β或体外培养的神经元或胶质细胞中加入IL-1β可引起星形胶质细胞、小胶质细胞增生和局部血管再生，NGF的合成；IL-1ra能抑止大鼠脑损伤后神经生长因子的产生和胶质细胞的增生[44]，提示IL-1β具有增强神经元的抗损伤和促进修复的作用。

3．IL-

IL-8是分子量8-10KD的多肽，在CNS内小胶质细胞和星形胶质细胞在IL-1β、TNF-α作用下可分泌IL-8[45]。IL-8对中性粒细胞的作用是多方面的，包括：诱导形状变化，释放溶酶体酶，诱导呼吸爆发，产生超氧化物和过氧化氢，生成生物活性脂以及增加粘附分子在中性粒细胞上的表达等[46]。

Matusmoto等[47]发现脑缺血再灌注后6小时脑匀浆内的IL-8浓度显著升高，血浆水平没有变化；再灌注早期应用抗IL-8抗体治疗可明显减轻再灌注6小时后的脑水肿和12小时后的脑梗塞范围。Yamaski等[48]用大鼠脑缺血模型发现单纯缺血没有再灌注不能引起脑内IL-8的升高。kossmann等[49]发现脑创伤后脑脊液中升高的IL-8能促进NGF的产生，表明IL-8也有一定的保护作用。总之，IL-8在脑缺血再灌注损伤中起重要作用，但其作用机制还需进一步阐明。

二、抗炎细胞因子

1、IL-

IL-1ra是分子量为17KD的多肽，在结构上与IL-1相似，能与IL-1竞争结合IL-1受体，但不引起信号传导[50]。分泌IL-1的细胞同样可以分泌IL-1ra[51]，CNS内广泛存在其表达区域[52] 。脑缺血再灌注后，脑内IL-1ra mRNA和蛋白含量升高；局部或全身应用IL－1ra能减轻脑缺血再灌注损伤，具有神经保护作用[39、51、53－56]。IL-1ra发挥神经保护作用的机理是与IL-1竞争结合IL-1受体，但不产生任何IL-1样的生物学效应。

2、IL-

T细胞（主要是TH2）、B细胞、单核/巨噬细胞、内皮细胞、小胶质细胞和星形胶质细胞均能分泌IL-6。Saito等[35]发现沙土鼠脑内的IL-6水平在脑缺血再灌注的早期升高，他们认为这可能与中性粒细胞和巨噬细胞的浸润有关；而IL-6水平的持续性升高可能与星形胶质细胞大量分泌IL-6有关。Maeda等[57]的研究表明：培养的鼠星形胶质细胞经历缺氧/再给氧后，以时间依赖性的方式促进IL-6的生成，IL-6的转录发生在缺氧期和再给氧的早期，而IL-6的合成和释放则发生于再给氧期，支持了Saito的结论。有些学者认为IL-6是一种促炎因子，能参与T、B淋巴细胞的成熟和分化，促进急性期反应蛋的合成等，但它在CNS内的促炎作用较弱，相反对缺血性脑损伤具有保护作用[58-61]。IL-6的神经保护作用可能与下述机制有关：（1）促进NGF的分泌[49、62]；（2）对抗兴奋性氨基酸的神经毒性。直接注射IL－6到大鼠脑内，可减弱NMDA对纹状体胆碱能神经元造成的损伤；而且它能促进大鼠中脑部位的儿茶酚胺神经元、前脑胆碱能神经元及海马神经元的存活[59、63]；（3）抑止TNF-α和IL-1β的合成[64]；促进抗炎因子IL－1ra和可溶性TNFⅠ型受体的生成[65、66]、对抗IL-1和TNF-α的生物学作用；（4）通过与边缘系统、下丘脑-垂体-肾上腺轴的相互作用促进CRH的释放，提高血中ACTH和皮质激素的浓度[67、68]，在一定程度上抑止缺血再灌注的炎症反应。

IL-6水平的升高具有神经保护作用，但当IL-6升高超过一定的限度后也可造成损害作用，如IL-6转基因鼠（星形胶质细胞持续表达高水平的IL-6）表现出较严重的神经变性症状，如行为异常、震颤、共济失调及惊厥发生[69、70]，并表现出血脑屏障的结构缺陷[71]。

3．IL-4和IL-

IL-4和IL-13同为活化的T细胞分泌的细胞因子，它们的基因紧密联锁，蛋白质有30%的同源性，在调节单核/巨噬细胞、B细胞、血管内皮细胞和造血祖细胞的功能方面具有相似的生物活性[72]。它们主要的生物学功能如下：（1）调节单核/巨噬细胞的功能，下调促炎细胞因子和趋化因子的合成，对于具有抗炎作用的IL-1ra及IL-1Ⅱ型受体（可结合IL-1但没有信号转导功能）的表达有促进作用[73、74]。它们下调单核细胞和巨噬细胞的细胞毒性和炎症活性，但对其呼吸爆发没有影响，并不影响甚至上调它们的APC功能[75、76]。它们抗炎作用的意义在于它们可以阻止IL-1β和TNF-α等诱导的内皮细胞活化和随之而来的炎症部位白细胞浸润等一系列过程，但同时能维持或促进单核/巨噬细胞的APC功能，抑止炎症过程中巨噬细胞分泌超氧化物 [77]，促进巨噬细胞表达甘露糖受体（MMR，该受体使巨噬细胞通过清除溶酶体和吞噬微生物而保护组织免受损害）。（2）诱导B细胞增殖，产生抗体；诱导B细胞表面标志表达。（3）强烈地抑LPS、IL-1β和TNF-α诱导的内皮细胞、单核细胞表达组织因子，抑止它们下调内皮细胞表达血栓调节因子的功能从而保护内皮细胞和单核细胞免受炎症介质介导的前凝血样变化。

目前还没有关于IL-4和IL-13与脑缺血再灌注损伤之间相互关系的报道，但我们推测脑缺血再灌损伤后IL-4和IL-13在脑内含量也可能较正常升高，因为：（1）机体免疫系统具有自稳态调节功能，脑缺血再灌注后大量炎性细胞在损伤部位聚集，产生大量促炎细胞因子。机体为了维持自身的稳定、保护组织器官的功能必然要抑止过度的炎症反应，产生抗炎细胞因子，而IL-4和IL-13是主要的抗炎细胞因子之一。（2）脑内正常情况下有T细胞存在[78]，成为IL-4和IL-13分泌的物质基础。已经证实：在过敏性脑脊髓炎自发性恢复的过程中，TH2细胞因子（IL－4、IL－10、IL－13）在脑内表达选择性上调[79]。IL-4和IL-13在脑缺血再灌注损伤过程中的变化尚需实验证实。

4．IL-

体外实验中IL-10可以抑止单核/巨噬细胞、中性粒细胞和小胶质细胞产生IL-1、TNF-α、IL-6[80、81]。在体内IL-10发挥广泛的抗炎作用，可以抑止IL-1～9、TNF-α、IFN-r等促炎细胞因子的产生，同时还能促进有抗炎作用的IL-1ra的合成[82] ，使机体内源性抗炎机制加强，有利于炎症的消除。

Zhai 等[83]于97年首次报道在大鼠大脑中动脉闭塞后6小时检测到IL-10 mRNA表达；Seper等[84]于98年报道IL-10能减轻大鼠局灶脑缺血后的继发性损伤，提示IL-10参与了脑缺血后的免疫抑止。

脑缺血再灌注损伤后免疫细胞和促炎细胞因子的作用已被公认，许多促炎细胞因子的抗体或拮抗剂已经初步试用于临床，取得了良好疗效，如IL-1ra具有副作用小[85]，疗效确实的特点。但对抗炎细胞因子特别是IL-10、IL-4和IL-13在脑缺血再灌注损伤中的作用的研究还处于起步阶段，对这些抗炎细胞因子的深入研究必将有助于脑血管疾病的治疗。

参考文献：见发表文章的杂志