体细胞移植前处理治疗椎间盘退行性病变的研究进展

作者：殷翰林 邓国英 赵庆华：单位：上海市第一人民医院

文章亮点：

摘要

背景：椎间盘退变引起的疾病严重影响着现社会，目前的治疗方案主要侧重于缓解疼痛症状，而无法阻止退变的进程。基于此，体细胞移植治疗正成为该领域的研究热点，而体细胞移植前的处理方法对于治疗效果至关重要。

目的：综述体细胞移植前处理治疗椎间盘退变的研究进展，为提高体细胞移植的疗效提供思路。

方法：由第一作者用计算机检索Pubmed数据库相关文献，检索时间为1995年至2016年，英文检索词为“stem cell transplantation， intervertebral disc degeneration”，相关文献包括综述、基础研究和临床研究，最终纳入69篇。

结果与结论：体细胞移植前的处理方法主要分为：髓核细胞共培养，生长因子处理，低氧处理，转染，组织工程复合体，力学刺激以及数量控制。然而现有实验多是在动物模型上进行，将其应用于临床治疗还需要更多的研究。

关键词：体细胞；移植前处理；髓核细胞共培养；生长因子；低氧；转染；组织工程复合体；力学刺激；数量；……基金

主题词：体细胞；移植前处理；椎间盘退变

基金资助：

Progress in pretreatment of stem cell transplantation in the repair of intervertebral disc degeneration

Yin Han-lin， Deng Guo-ying， Zhao Qing-hua (Department of Orthopedics， Shanghai First People’s Hospital， Shanghai 201620， China.)

Abstract

BACGROUND：Modern society is severely strained by the diseases arising from intervertebral disc degeneration (IVDD). Current treatments for IVDD may alleviate pain but fail to prevent the degenerative process of the IVD. As a result， stem cell transplantation represents a promising approach to IVDD. Furthermore， pretreatment of stem cells has been reported to be crucial to the advancement of the therapy.

OBJECTIVE：To review the progress in pretreatment of stem cell transplantation in the repair of IVDD， thus providing ways to improve the curative effect.

METHODS：Pubmed database was retrieved by the first author using computer to search relevant articles published from 1995 to 2016. The key words were “stem cell transplantation， intervertebral disc degeneration” in English. Then 69 articles were suitable for final analysis， including reviews， basic and clinical studies.

RESULTS AND CONCLUSIONS：Pretreatments of stem cell transplantation are as follows:co-culture of nucleus pulposus； treatment of growth factors； hypoxia； transfection； tissue engineering co

Subject headings：stem cell； pretreatment of transplantation； intervertebral disc degener

Funding：

0引言Introduction

椎间盘退变（intervertebral disc degeneration，IDD）是骨科临床常见病，接近40%的30岁以下人群以及超过90%的55岁以上人群受到不同程度的椎间盘退病变的影响[1]。椎间盘退变可导致严重的下腰痛[2]，是许多国家失业和致残的主要原因，给社会造成极大的经济负担[3]。传统椎间盘退变的治疗手段包括保守治疗和手术治疗，然而二者均无法有效恢复椎间盘的功能[4]。基于此，椎间盘退变的生物学治疗日益受到重视，其中体细胞移植治疗因为取材方便，多向分化潜能，同种异体移植不易发生免疫排斥反应，易于体外扩增等优势而受到广泛关注[5， 6]。目前体细胞移植面临的主要难题是体细胞在椎间盘特殊微环境中的存活、增殖、分化。体细胞移植前处理可以使体细胞更加适应椎间盘微环境，促进其增殖分化进而有效提高体细胞移植效率。

目前体细胞移植研究所使用的种子细胞主要是是骨髓间充质体细胞（BMSCs）和脂肪源性体细胞（ADSCs），另外关节滑膜源性体细胞（SDSCs）、人诱导性多能体细胞（hiPSCs）、肌肉源性体细胞（MDSCs）、髓核体细胞（NPSCs）、嗅神经体细胞等也有研究。体细胞移植前的处理方法主要分为：髓核细胞（NPCs）共培养，生长因子处理，低氧处理，转染，组织工程复合体，力学刺激以及数量控制。现就不同类型体细胞移植前处理做相关综述于下。

1资料和方法Data and methods

1、1检索策略 由第一作者用计算机检索Pubmed数据库相关文献，检索时间为1995年至2016年，检索词为“stem cell transplantation， intervertebral disc degeneration”。

1、2入选标准

纳入标准：①具有原创性，论点论据可靠的体细胞移植前处理研究文章。②文献主题内容与椎间盘退变的体细胞移植治疗联系紧密的文章。

排除标准：①重复性研究。②与椎间盘退变的体细胞移植治疗联系不紧密的文章。③统计方法不科学的文章。

1、3 资料提取和文献质量评价

资料提取：共检索到150篇文章，按纳入和排除标准对文献进行筛选，共纳入69篇文章。以此为依据对体细胞移植前处理治疗椎间盘退行性病变，进行归纳和总结。

文献质量评价：全部为英文文献，其中部分为综述，大部分为实验性论著。

2结果Results

2、1 髓核细胞共培养

与NPCS共培养，可促进体细胞向髓核样细胞表型分化，更有利于适应椎间盘内的微环境。

2、1.1

BMSCs与NPCs共培养可促进BMSCs向软骨样细胞分化，且同二者比例相关。NPCs:BMSCs为75：25和50：50时，蛋白多糖和糖胺聚糖的合成速率最大[7]。

NPCs共培养促进MSCs向软骨样细胞分化的可能原因有：一是旁分泌刺激途径[8]NPCs分泌的各种细胞因子和生长因子可促进MSCs向类髓核表型转化[8， 9]，与此同时MSCs旁分泌产生的可溶性细胞因子可下调NF-κB信号通路以及上调TGF-β、胰岛素样生长因子-1（IGF-1）、表皮生长因子（EGF）和血小板衍生长因子（PDGF）的表达，进而促进NPCs的有丝分裂以及组织恢复[10-13]。二是细胞融合途径。细胞融合可增强成体体细胞的可塑性以及组织修复的能力[14， 15]。然而在MSCs与NPCs共培养体系研究中，细胞融合是否真正起到作用，仍然存在着争议[16， 17]。

2、1.2

目前移植治疗椎间盘退变的研究中ADSCs的使用十分广泛，仅次于BMSCs。

共培养系统中，ADSCs可通过刺激退变NPCs分裂和基质合成，提高退变椎间盘中NPCs的恢复能力[18]。在非接触共培养研究中，发现NPCs可诱导ADSCs向髓核表型分化，而具体的原因主要与NPCs分泌的可溶性因子有关[19]。

2、1.3

研究发现，共培养体系中，SDSCs可通过抑止NPCs中与基质降解酶和炎症细胞因子相关的基因表达，减少炎症反应的发生，促进组织的恢复[20]。

2、1.4 h

有学者发现将猪髓核组织，粉碎后直接或通过隔加入到hiPSCs的培养皿中，可观察到三种脊索细胞标志基因的高表达：Brachyury T，细胞角蛋白-18和细胞角蛋白-8。表明了人诱导性多能体细胞向脊索样细胞的分化。而体外实验证实这些脊索样细胞具有向髓核样细胞分化的能力[21]。与NPCs或脊索细胞共培养可提高hiPSC向髓核样细胞分化能力在其他实验中已得到证实[22， 23]。

2、1.5

研究表明在体外共培养可促进NPCs与MDSCs蛋白多糖、糖胺多糖的表达以及增强NPCs增殖能力，且当比例为75：25时，这种作用最明显[24]。

嗅神经体细胞

有学者研究了嗅神经体细胞与退变髓核组织的共培养，结果发现几乎100%嗅神经体细胞均表达了NPCs减震功能所必需的两种蛋白：CT2和CSPG，细胞形态学观察显示了二型胶原合成的增多，这些均表明嗅神经体细胞向NPCs软骨样表型分化[25]。

总的来说，体细胞移植前与NPCs共培养可促进细胞外基质合成，诱导体细胞向髓核样细胞转化，显著提高治疗的成功率。

2、2生长因子处理

MSCs的分化可受到一系列细胞因子影响，主要包括转化生长因子-β（TGF-β），胰岛素样生长因子（IGF），骨形态发生蛋白（BMP），血小板源性生长因子（PDGF）， 成纤维细胞生长因子（FGF）等 [26]。

TGF-β1可通过提高丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）活性，促进Sox-9、Smad-3、二型胶原、聚集蛋白聚糖等基因的表达使多种细胞合成和分泌细胞外基质[27， 28]，也可作为诱导因子，诱导BMSCs[26， 29]或SDSCs[30]呈现髓核样细胞表型。另外BMPs也可诱导BMSCs分化为髓核样细胞表型[31]，且与TGF-β1具有协同效应[32]

TGF-β3可促进多种细胞类型的软骨样分化[33， 34]，Tao， Y等探究了TGF-β3和IGF-1对于NPSCs的增殖能力，生存能力，向NPCs表型分化的能力的影响以及潜在机制。结果表明，TGF-β3和IGF-1之间的协同效应提高了NPSCs的生存能力，细胞外基质的生物合成水平以及向NPCs的分化能力，其作用机制与MAPK/ERK通路的活化有关[35]。因此NPSCs移植前用TGF-β3和IGF-1处理，移植后效果可能更好。

此外PDGF和FGF对MSCs的增殖以及软骨样分化的促进作用也已得到证实[36]

在生长因子应用过程中，也存在一定的风险。如过高浓度的BMP2或TGF-β会导致骨生成和肥大[37-39]，因此浓度的控制十分重要。

总的来说，生长因子的处理有利于体细胞的髓核样分化和细胞外基质的合成，然而也存在着失控的风险，但是通过合理地控制各种生长因子的浓度和比例是可以显著降低这种风险的，因此生长因子的预处理是有效的。

2、3低氧处理

椎间盘是机体最大的无血管组织，存在特殊的低氧环境[40]，退变椎间盘中，氧气浓度，葡萄糖浓度进一步降低，基质酸度升高。这些不利的环境条件可能会严重影响移植体细胞的生存和组织修复能力，给椎间盘退变的体细胞移植策略提出了挑战[41]。因此增强体细胞应对椎间盘微环境的能力，显得十分必要。而目前针对性的预处理方式主要为低氧预处理。低氧处理对体细胞的作用主要有以下三方面：1提高生存率。在体内，缺氧的环境会导致MSCs的凋亡，这与线粒体功能失调引发的Caspase-3活化[42]以及MSCs内源性CSE（细胞胱硫醚-γ-裂解酶）/H2S系统的抑止[43]有关。而低氧预处理后，可诱导MSCs促生存基因如Akt的大量表达，有利于HIF-1α稳定性的维持，减少缺氧造成的细胞死亡[42]。2 促进增殖分化。低氧可促进MSCs的增殖和分化，调节MSCs的旁分泌，促进许多分泌因子的表达如：VEGF和IL-6[42]。低氧预处理可促进MSCs成软骨相关基因和标志的表达，GAG、聚集蛋白聚糖和二型胶原的积累，诱导MSCs向髓核样细胞分化[44-46]，这与低氧促进了AKT和p38MAPK（丝裂原活化蛋白激酶）和磷酸化以及HIF-1α的激活有关[47]。3 迁徙归巢。缺氧在MSCs的迁徙和归巢中起着重要的作用，主要依靠其促进间充质细胞源性因子-1以及其受体CXCR4的表达来实现的[42]。

总体而言，低氧预处理可以显著增强MSCs应对椎间盘不利微环境的能力。

2、4转染

通过基因转染，可有效调节细胞分化，增强细胞旁分泌能力，提高细胞抗性。在近些年的研究中，细胞移植前基因的转染，主要集中在SOX家族基因和Bcl-2基因上。

2、4.1

SOX9是属于SOX蛋白家族的一个转录因子，对于成软骨和二型胶原合成十分关键，被称为软骨表型的关键调控者[48， 49]。有研究已证实SOX9转染BMSCs有利于其软骨样分化[50]。还有实验在大鼠模型上研究了腺病毒介导SOX9转染的BMSCs移植治疗椎间盘退变的效果，结果观察到转染组细胞外基质量的增多以及髓核结构得到了更好的保持，表明了SOX9转染大大增强了BMSCs对退变椎间盘的修复作用[4]。

此外已有许多研究证实SOX-5，SOX-6和SOX9共转染可诱导ADSCs和BMSCs的软骨样分化[51-56]，然而对于退变椎间盘的修复作用有待更多体内实验验证。

2、4.2 Bcl-

Bcl-2基因是细胞凋亡通路中的一个关键的调节者[57]。Bcl-2基因的过度表达可延缓细胞死亡，强细胞的生长力[58]。因此Bcl-2基因的转染将有利于体细胞在 椎间盘微环境中的生存。

Fang， Z.等研究了GFP-Bcl-2转染的BMSCs在缺氧条件下生存力和功能的改变。结果与未转染组相比，转染组凋亡率更低，Sox-9、聚集蛋白聚糖、二型胶原和蛋白多糖等与软骨相关的基因表达更旺盛。表明移植前进行GFP-Bcl-2转染可提高BMSCs在缺氧条件下的生存力以及促进其向髓核样细胞的分化[59]。

2、4.3其它

除了基因过表达外，还可通过沉默的方式实现对体细胞的调控。最近的一项研究表明，对一种抗软骨形成因子miR-221进行沉默可在体外和体内高效促进人MSCs的软骨化，而且该过程不需要软骨诱导因子TGF-β的作用。研究人员瞬时转染microRNA拮抗剂将miR-221沉默，首先在3D培养基上对这种方法的可行性进行了验证，随后在体内模型中进行了验证[60]。然而该方法应用于椎间盘退变的修复有待进一步证实。

基因转染可以高效地调控体细胞基因的表达，诱导体细胞的增殖分化。然而基因转染可能带来的生物安全问题，也是我们不能忽视的。

2、5组织工程复合体

体细胞移植进椎间盘有三种方式[61]：直接注入；随支架注入；基因转染后注入。

其中随支架注入的前提即为构建组织工程复合体，组织工程复合体模拟了ECM的三维框架结构，有利于体细胞移植后的存活，分化，功能维持等，其具体作用分为：直接作用，间接作用和附加作用。

直接作用：促进体细胞的黏附与迁徙，进而维持体细胞的活性，有利于其存活[62]

间接作用：促进细胞外基质的合成和体细胞的软骨样分化。这对于治疗椎间盘退变具有十分重要的意义。有学者将透明质酸作为ADSCs的支架植入犬退变椎间盘中，结果观察到了二型胶原和聚集蛋白聚糖基因的高表达和细胞外基质的显著增多[63]。还有实验证实了TF水凝胶作为NPSCs（NPSCs）支架时，若弹性系数低，则促进NPSCs向软骨分化，弹性系数高，则促进NPSCs向骨分化[64]。

附加作用：传送和释放促进细胞定植和祖细胞产生的药物[65]

目前有许多生物材料可用于构建组织工程复合体，包括水凝胶、一型胶原、透明质酸、纤维蛋白、藻酸钙、壳聚糖和二型胶原等，但是哪种材料取得的效果比较好依然需要更多研究证明。

2、6其它

2、6.1力学刺激

Sun， Z等探究了力学刺激条件下ADSCs对NPCs的影响，二者在压力刺激环境下共培养。结果表明，ADSCs保护NPCs不让其凋亡，涉及到的机制有：抑止caspase-9和caspase-3的活性，上调与ECM相关基因的表达，下调基质金属蛋白酶的合成和炎症因子的产生[66]。因此体细胞移植前进行力学刺激的处理将有利于髓核组织的修复，移植后效果更好。最新研究揭示了体细胞如何通过改变其细胞核中DNA的组装方式来感知并且对外部机械力做出反应：机械力通过一种名为emerin的关键蛋白质在核被膜上被感知，emerin将细胞核同DNA的结构骨架联系起来，之后DNA的包装发生全面变化，转录活性发生全面改变[67]。ADSCs在压力刺激下的分化可能也与之有关。

2、6.2数量控制

有学者建立了犬椎间盘退变模型来研究用于移植治疗椎间盘退变的MSCs的最佳数量。三组分别移植10（5），10（6）和10（7）个MSCs，正常椎间盘和未移植体细胞的退变椎间盘组作为对照。与正常椎间盘组相比，移植组椎间盘高度和纤维环结构保持的更好。MSCs和NPCs存活率的分析表明，10（6）组与10（5）和10（7）组相比，存活率更高，对椎间盘结构的保持和对减缓退变的效果比较好[68]。该实验证明了体细胞移植数量对于治疗效果的重要性，该实验的不足在于只是在犬椎间盘退变模型上进行的，临床应用中，体细胞移植的最佳数量会有所不同，而且会受到退变程度的影响[69]，但是不可否认的是，移植前处理时对体细胞数量的控制有十分重要的意义。

3小结Conclusion

基于上述分析，体细胞移植前处理有利于提高其移植的疗效，本文总结了已经使用过的体细胞移植前处理治疗椎间盘退变的方法，包括：与NPCs共培养，生长因子处理，低氧处理，基因转染，组织工程复合体，力学刺激以及数量控制。体细胞移植前处理，在体细胞移植治疗椎间盘退行性病变中，具有较强的应用前景。

作者贡献：第一作者构思并设计本综述、资料收集、查阅文献和成文，通讯作者审校，第一作者和通讯作者共同对文章负责。

利益冲突：文章及内容不涉及相关利益冲突。

伦理要求：未涉及伦理冲突内容。

作者声明：

①论文是作者独立取得的原创性研究成果，未曾在国内外公开发表过。

②所投稿件没有一稿二（多）投。

③未将一篇论文稍作修改多次投稿或分成多篇论文进行多次发表。

④没有抄袭、剽窃行为，明确说明使用过或引用过自己的工作等。

⑤论文作者单位和作者署名排序无争议。

⑥不涉及保密和拟申请专利内容。

⑦除文中特别加以标注和致谢，不侵犯任何版权或损害第三方的任何其他权利。

术语介绍：体细胞移植治疗，是一门先进的医学技术，为一些疑难杂症的治疗带来了希望。体细胞移植治疗是把健康的体细胞移植到患者体内，以达到修复或替换受损细胞或组织，从而达到治愈的目的。体细胞移植治疗范围很广，一般能治疗神经系统疾病、免疫系统疾病、还有其他的一些内外科疾病。体细胞在医学界被称为“万用细胞”，它可以分化成多种功能细胞或组织器官。

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