干细胞应用在中枢神经创伤修复

新近的一些研究结果表明，神经干细胞neural stem cells 在中枢神经组织损伤修复neural functional repairing 的治疗中具有广阔的应用前景，但是神经干细胞要应用于临床仍有许多问题尚未解决。

一、神经干细胞的来源

1. 胚胎组织来源

胚胎组织来源的神经干细胞研究较早，技术方法已较为成熟。它包括来源于早期胚胎的全能干细胞和来源于胎儿神经组织的多能干细胞。研究发现，来自早期胚胎（桑椹胚—胚泡）的细胞具有发育全能性（Totipotent），在合适的环境条件下可以发育成为完整的个体（包括体内三个胚层220余种类型的细胞），这种早期胚胎细胞称为全能干细胞。胚胎全能干细胞能在体外长期培养，并具有高度未分化性，在特定条件下可分化发育为胎儿或成体内的包括神经干细胞在内的各种类型组织细胞。来自胎儿神经组织的神经干细胞已被许多学者所证实，越早期的胎脑中神经干细胞的比率越高，至出生时则只有脑室周围区域，纹状体区会有一定比例的神经干细胞。

虽然从胚胎来源的神经干细胞的研究较多，获取的神经干细胞较为容易、数量多。但是只能局限于动物实验研究，要获取人类早期胚胎（胚泡）和胎儿脑组织往往十分困难，除受到技术条件、来源和数量的限制外，还涉及到道德、组织免疫排斥反应等一系列问题，这使得人胚神经干细胞的研究及临床应用受到制约。

2. 成体组织来源

成体来源是指从成体神经细胞中或成体非神经组织中获取神经干细胞。成体神经组织来源的神经干细胞包括从出生到成年期脑组织的广泛区域。不管是人类还是不同种属的动物，虽然成体来源神经干细胞有生物学特性的差异性，但其存在部位具有很大的一致性。许多研究发现在成年动物脑室下区，纹状体、海马齿状回、脊髓等区域均存在有神经干细胞。Vescovi和Uchida采用人类细胞克隆分析技术，证实了可以从人类胚胎脑中分离出神经干细胞。Pagano和Roy在研究中发现，成人嗅球和大脑白质存在神经干细胞及其前体细胞。来源于成体中枢神经组织的神经干细胞虽然在脑和脊髓中都广泛存在，但是由于其数量极少，获取困难，且在获取神经干细胞时具有引起神经功能损害的危险性，因此在临床实际应用的可行性甚小。

目前成体非神经组织来源的神经干细胞的研究报道逐渐增多，主要集中于骨髓、脂肪、皮肤等组织，其中以骨髓来源的成体神经干细胞方面的研究较多。其主要方法是抽取动物或人体骨髓，分离获取骨髓基质细胞，通过诱导分化，纯化等获得神经干细胞。骨髓源成体神经干细胞具有来源充足，获取容易，同时自体骨髓源成体神经干细胞移植无免疫排斥反应和避免了争议。但是骨髓基质细胞向神经细胞的诱导分化过程技术难度很大。我们研究所在近几年开展了大鼠、兔、猫、犬、猴和人体的骨髓基质细胞向神经细胞诱导分化的系列研究，较好地解决了有关诱导分化的技术问题，使骨髓源神经干细胞诱导分化的成功率和向神经干细胞分化的比例大大提高。

二、神经干细胞定向诱导分化和增殖调控

神经干细胞分化调控受到细胞内、外环境多种复杂因素的影响，所谓神经干细胞的定向诱导分化是指给予适当的相关条件，对神经干细胞的分化和增殖进行诱导和调节控制，使之向指定的方向发展。下列因素可能参与了神经干细胞的分化增殖的调控过程。

1.细胞因子诱导分化的作用

某些细胞因子可以在一定程度上诱导神经干细胞的分化，但目前尚没有哪一种细胞因子能在体外将神经干细胞全部诱导分化为所需的功能（目的）神经细胞；Li等（2000）曾报道维甲酸（Retinoic acid，RA）和神经生长因子（Nerve growth factor,NGF）是定向诱导胚胎干细胞（Embryonic stem cell,ESC）分化为神经细胞的常用细胞因子，用含RA的培养液对来自于胚胎干细胞并含有外、中、内三个胚层的胚胎小体进行贴壁培养，可高效和可重复地分化出神经细胞，这些细胞表达神经丝M和微管蛋白，有钠、钾等离子通道的特征；若用RA对ESC经过2～3周诱导，则可使培养的ESC向神经细胞分化，形成有典型神经冲动等电生理反应的神经细胞，并具有神经元特异细胞骨架，突触囊泡蛋白等。RA虽然在诱导ESC向神经干细胞分化中具有十分重要作用，但是在诱导ESC向神经干细胞分化时并非都分化成为所需的功能（目的）神经细胞，据报道仅有10～30% ESC分化为神经元，而大部分则分化为星形胶质细胞，少突胶质细胞；同时，在应用RA诱导ESC分化为神经干细胞时尚需要其它细胞因子参与，除前述的RA外，还有白细胞介素类（包括IL—1、IL—7、IL—9、IL—11等），生长因子类（如神经生长因子（NGF）、碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）、上皮生长因子（EGF）、胶质细胞源性神经营养因子（GDNF）等）。不同种类的细胞因子、同一细胞因子不同浓度，以及多种细胞因子联合应用对神经干细胞诱导分化作用各不相同。在神经干细胞发育分化的不同阶段，相同细胞因子的作用亦不同。多项研究显示，神经干细胞具有很强的分化为功能神经细胞潜力，通过在神经干细胞分化发育不同阶段筛选定向诱导分化作用最佳的细胞因子，或探索细胞因子组合最佳方案，可以在一定程度上提高神经干细胞定向分化比例。

2.基因调控神经干细胞分化的作用

虽然不同的细胞因子在神经干细胞的诱导分化中作用重要，但神经干细胞作为一种大脑神经组织细胞的前体细胞，仅仅依靠加入某种或某几种细胞因子或改变细胞培养条件很难使其按人们的意愿定向分化为执行大脑某一特定神经功能的功能神经细胞。要解决根本问题，需考虑由基因水平进行干预。而要实现在基因水平上的调控，首先必须明确前体细胞向神经干细胞分化的主要调控基因的种类和性质，特别是要明确发育分化不同阶段决定神经干细胞向所需功能神经细胞定向分化的主导基因，还需激活或沉寂哪些基因等。生物的表型变化主要由其内在的、所表达的基因所确定。就分化细胞与祖细胞，激活细胞与静止细胞，突变细胞（如肿瘤细胞）与正常细胞之间而言，都存在着基因差别表达。若能在这些关系密切的细胞群之间发现那些有差别表达的基因，则可为这些相关细胞群所发生的复杂代谢和功能变化提供有意义的信息。已有研究表明，基因转导方法可以调控神经干细胞定向分化，例如，可以将多巴胺羟化酶（TH）基因导入神经干细胞，通过诱导分化，获取多巴胺能神经细胞。

3.信号转导在神经干细胞定向分化中的作用

有研究表明，经NOTCH信号转导途径可以调控神经干细胞定向分化。NOTCH原本是指果蝇中的一种特定突变形式，后在哺乳动物中也克隆了一系列NOTCH同源分子。1998年，Li的研究发现，Notch信号系统的激活抑制胚胎干细胞的分化-当Notch被激活时，干细胞进行增殖；当Notch活性被抑制时，干细胞进入分化程序，发育为功能细胞。

作为一种信号转导途径，NOTCH信号系统的信号传递过程尚未完全明了。目前认为Notch受体是一种整合型膜蛋白，是一个保守的细胞表面受体，它能通过与周围配体表达的细胞直接接触而被激活。其信号传导流程开始于NOTCH受体与配体结合后受体的胞浆区从细胞膜上脱落，并向细胞核转移，将信号传递给下游信号分子。该途径的信号的传递主要是通过蛋白质相互作用，引起转录调节因子的改变，或将转录调节因子募集到靶基因上，实现对特定基因转录的控制。当NOTCH功能缺陷时，这种“旁侧抑制机制”消失，神经元产生过多，导致胚胎死亡；反之，当NOTCH分子基因突变而使其活性增强时，干细胞分化受到影响，胚胎中成神经细胞的分化受到抑制。因此，找到调节NOTCH信号途径的方式，就有可能通过NOTCH信号的改变来精确调控神经干细胞向功能神经细胞分化的过程和比例。

由于脑的神经功能极为复杂，不同种类的神经元担负着不同的神经功能，如胆碱能神经元、肽能神经元、5-HT能神经元和儿茶酚胺能神经元（包括多巴胺能神经元、去甲肾上腺素能神经元）等，不同的神经元虽然在形态结构上基本一致，但其担负的功能却各不相同，上述不同功能的神经元分布在脑内某些特定部位，通过合成释放相应的神经递质或介质发挥各自特有的神经功能。因此，就目前的研究水平还很难真正实现神经干细胞定向诱导分化。多数情况下，所获得的神经干细胞并非是具有某一特定功能的神经干细胞。

三、神经干细胞移植及其对中枢神经损伤的治疗作用机制

1.神经干细胞移植治疗中枢神经损伤适应证

神经干细胞移植适用于脑或脊髓损伤造成的神经功能损害，如外伤性运动性或感觉性失语、大脑皮质运动区损伤造成的偏瘫或单瘫、持续性昏迷状态、脊髓损伤造成的截瘫等。

2.神经干细胞移植的几种常用方法

神经干细胞移植方法包括：①细胞悬浮液立体定位注射法；②胶原基质包埋移植法；③生物材料（PGA、PLA等）吸附移植法；④静脉内细胞悬液输入法；⑤脑室内或腰穿细胞悬液注射法。在这些移植方法中，前三种方法通常是采用CT立体定向导引或在神经导航系统指引下进行定点移植，相邻注射点之间最小间距为5mm。后两种方法是将神经干细胞制成107/ml的细胞悬浮液，经静脉滴注或经脑室及腰穿将神经干细胞悬浮液注入脑脊液中，通过细胞迁移作用向脑或脊髓损伤区迁移聚积。

3.神经干细胞移植治疗中枢神经损伤的可能机制

神经干细胞移植治疗中枢神经损伤的机制目前尚不十分清楚，可能与下列因素有关：①从结构上修复神经组织损伤，使受损的神经通路得以再通；②植入的神经干细胞与定居部位神经组织间相互作用，并产生某些细胞因子，如类、神经营养因子类、白介素类、巨噬细胞集落刺激因子和干细胞因子等，这些细胞因子不仅可以促进神经功能的修复，也可以保障植入的神经干细胞的存活、增殖，并诱导神经干细胞向受损部位迁移。③神经干细胞具有向血管内皮祖细胞（endothelia progenitor cells, EPCs）和神经细胞方向分化的作用，有利于受损区神经、血管组织的修复，神经干细胞自血液循环和脑脊液循环向受损脑（脊髓）区域迁移的机制不明，可能与血-脑屏障及脑脊液-脑屏障开放和某些细胞因子的诱导有关。

四、展望

神经干细胞的来源、定向诱导分化和移植修复因创伤造成的脑脊髓神经功能损害的研究虽然取得了重要进展，但我们认为，用于临床之前尚有大量工作需要做，这些工作包括：①解决神经干细胞的定向诱导分化和纯化；②安全性：要完成致瘤性、毒性和免疫实验等；③有效性：在动物实验中要观察移植的神经干细胞的成活与周围神经细胞是否有突触联系，有无合成相关的神经递质，有关神经电活动及神经功能损害有无改善等。总之，虽然神经干细胞的研究才刚起步，困难仍然很多，但是其临床应用前景是广阔的，相信在不远的将来神经干细胞移植修复创伤性脑和脊髓损伤的研究一定会取得重大突破。