不孕症的检查与诊断《十二》

  第12节　免疫学检查
 
  免疫不育包括男性抗精子自身免疫不育－女性抗精子同种免疫不育的女性抗透明带免疫不育。
 
  一、抗精子免疫不育的检查
 
  抗精子免疫抗精子体液免疫（抗精子抗体）和抗精子细胞免疫。
 
（一）抗精子抗体的检测
 
  1.后试验　于后6-24h内取宫颈粘液，在高倍镜下观察计数精子数。每高倍视野中，有>=21条检度活泼的精子者为比较好，有6-20条很活泼的精子为良好，有1-5条活动精子属尚好，有少数不活动精子为较差，无精子者为阴性。
  实验受测试夫妇心理和情绪情况及宫颈粘液中的理化特征等非免疫性因素的影响，可作为检测生殖道局部抗精子抗体的初筛手段。
 
  2.精子-宫颈粘液接触或穿透试验（SCMC或s-c　MPT）SCMC是将与排卵前宫颈粘液混合孵育，镜下观察精子震颤现象，>50%为阳性，提示可能有局部抗精子抗体存在，s-c　MPT是将宫颈粘液装于毛细血管中，开口端加孵育后镜下观察5个以上活精子到达的最远距离，<20mm为穿透不良，>20mm为穿透良好。本试验可受非免疫因素影响，如精子的活力、宫颈粘液的理化性质等。
 
  3.精子凝集试验　精子抗原与抗体结合后可发生凝集反应，凝集反应是抗原与特异性抗体反应的传统及敏感的方法，通过肉眼或显微镜观察结果。检测方法包括下列几种。
 
（1）明胶凝集试验（GAT）：适当稀释的精子悬液与10%明胶溶液混合后加入待测血清孵育，2h后若出现絮状物为阳性。此法简便，每次设阴性及阳性对照组，则结果较可靠。
 
（2）试管玻片凝集试验（TSAT）：按要求稀释的精子悬液与待测血清孵育2-4h后，镜下观察>=10%凝集为阳性。此法能观察凝集类型，方法简便，但可受多种因素干扰，如微生物、组织碎片，血中雄激素升高，均可发生非特异性凝集。每次试验需设对照组。
 
（3）浅盘凝集试验（TAT）：使用特制浅盘，只需检测样本几微升（ul），在倒置显微镜下观察>=10%凝集为阳性。此法所用样本较TSAT少，可同时检测较多的血清样本，较GAT敏感，亦少受非特异性因素干扰。若血清效价>=1：32，则可认为确含精子抗体。
   其他尚有毛细管凝集法及平板凝集法，较少用。
 
  4.补体依赖性细胞毒试验及精子制动试验　精子抗体与精子抗原结合，激活补体系统，导致细胞膜通透性及完整性的损害，若为制动抗体，使精子失去活力，制动值>=2为阳性；若为细胞毒抗体，则用某些染料染色阳性，要求精子活率>70%。微量法仅需样本几微升，对精子活动率较低的样本，可用上游法提取活精子，活率可达90%以上。本法仅能检测作用于精子尾干的抗体。特异性强，敏感性差，假阴性率较高。
 
  5.被动血凝法　用精子提取物及精浆包被经处理的红细胞使之致敏，将致每红细胞与待测稀释血清在微量反应板上进行反应，出现红细胞凝集为阳性。此法不受精子活率、计数、中微生物或组织碎片的影响，研究者认为此法特异、敏感，但报道较少，其可靠性及实用性尚待证实。
 
  6.酶联免疫吸附试验（ELISA）及生物素-亲合素酶联免疫吸附法（BA-ELISA）应用完整精子或精子膜抗原包被固相载体，待测样本中精子抗体与之培养后可结合于抗原表面。随之酶标第二抗体亦可结合其表面，后经加酶底物，根据底物显况判断结果。可用肉眼观察，亦可用酶标仪测定，后者客观准确，一般以大于一组阴性血清光密度均值加2倍标准为阳性。由于完整精子包被易致非特异性吸附，因此若以可溶性精子膜抗原包被，则本法敏感、特异、客观、定量，能确定抗体类型，且易操作。BA-ELISA是在常规ELISA基础上发展起来的新一代定量检测法，其敏感法性、特异性超过常规法。
 
  7.免疫珠试验（Immunbead Test,IBT） 用抗人免疫球蛋白抗体包被的聚丙烯酰胺微能结合于结合了精子抗体的精子表面，在相差显微镜或电子显微镜下可见到免疫珠随精子运行，若结合一个或多个免疫珠的精子比例>=10%为阳性。此法可确定抗体的部位、类型及结合精子的比例，能测出活精子表面结合的抗体。其敏感性、特异性及重复性较好，操作稍繁琐，检测所需样本少，可用于宫颈粘液、输卵管液等微量样本的检测。
 
  8.放射性标记免疫球蛋白或A蛋白法　同位素标记的抗人免疫球蛋白或葡萄球菌A蛋白与结合在精子表面的精子抗体结合，用X计数器测定精子表面的放射活性。若以活精子作为抗原其特异性及敏感性较高，且可确定抗体类型。但由于每次实验活动精子来源不同，其结果重复性较差；且设备昂贵，操作者易受放射性损害，故此法报道较少。
 
  9.间接免疫荧光试验　精子表面结合于抗原后，能与标有荧光素的第二抗体结合，在荧光显微镜下观察呈现荧光的阳性精子比例。因试验中需要甲醇固定致精子膜损伤，内部抗原外露，而抗内部抗原的抗体在正常人中普遍存在，故假阳性太，无临床实用价值。近年来，作液相培养，实验过程中无需固定，又重新确定了本法的使用价值。
 
  10.精卵相互俢直接检查法
 
（1）精子-透明带结合或穿透试验：自腹腔镜检查中获得的人卵与精子在一定条件下孵育后，观察精子能否穿过透明带进入细胞周围的空间，若精子不能穿过透明带，考虑有制动抗体存在，此试验亦受其它因素干扰。
 
（2）精子-去透明仓鼠卵穿透试验（SPA）：将优化提取的的活精子与无带仓鼠卵混合孵育，在相差显微镜下观察，若卵内含肿胀精子头（带尾）为已经穿透。SPA可用于判定：①有精浆抗体的精子的受精能力；②各种抗体在阻止受孕时的重要性。此试验也可受多种因素影响。
 
（二）抗精子细胞免疫的检测
 
  对细胞介导的抗精子免疫的研究资料较少，各家结论不一。动物实验及人体检测表明，抗精子细胞免疫可可甬不育的原因之一。
 
  检测细胞介导抗精子免疫反应的试验主要有淋巴细胞转化试验、白细胞粘附抑制试验、白细胞或巨噬细胞移动抑制试验、皮肤试验及外周血白细胞促凝血活性法等。所采用的抗原不一，有新鲜洗涤精子、冻融精子、半纯化精子等。目前，因使用的抗原不统一，检测方法各异，研究倒数较少，各种方法的特异性尚难评价，其结果亦难于比较。
 
  二、抗透明带免疫性不孕症的检测
 
  人卵透明带来源有限，很难获取，但人透明带与猪透明带间有交叉抗原性，因此实际工作均用猪透明带代替人卵透明带用于检测人血清中透明带抗体。由于部分正常粉血清中存在异种凝集素（主要为IgM）干扰实验结果，因此检测前需用新鲜猪红细胞待测血清。
 
  1.透明带沉淀反应　透明带表面结合抗体后，在光镜或暗视野镜下呈现折光改变。本法多用于鉴定血清、敏感性低，难用于临床。
 
  2.放射免疫法　用放射性标记的猪透明带抗原与待血清培养后，分离出抗原体复全物，测定其放射性。本法能定量，特异性及敏感性较好，但由于放射性损害，且报道不多，故本法尚难肯定。
 
  3.间接免疫荧光试验　人抗透明带抗体结合至猪卵表面后，标有荧光素的抗人免疫球蛋白抗体随之结合至透明带表面，在荧光显微镜呈现明显的卵周荧光。本法的可靠性有赖于其它客观方法证实。
 
  4.ELISA及BA－ELISA法　以猪透明带抗原包被固相载体，另加待测血清、酶标第二抗体及底物，分步培养洗涤，最后根据底物颜色变化情况判断情况。本法所需样本量少，无需特殊设备，操作简便，能定量测定抗体并确定抗体类型，特异性及敏感性较好。BA－ELISA具有常规ELISA的优点，而其敏感性大为提高。
 
  5.被动血凝法　用纯化的猪透明带抗原包被其他物种的红细胞为抗原靶标，在存在透明带抗体的情况下，致敏红细胞发生凝集。此法研究报道较少，难以评价其敏感性和特异性。
 
  6.精子－透明带结合或穿透试验　若存在透明带抗体或抗精子抗体，此法均可阳性。由于试验受培养环境因素影响较大，故对不同实验室的研究结果难以比较。此法可与其它方法配合应用，相互补充，以保证结果的可靠性。