阪崎肠杆菌 检测

　　阪崎肠杆菌(E.sakazakii)是一种周生鞭毛、能运动、无芽孢的革兰阴性细菌，是肠道正常菌群的一种，在一定条件下可引起人和动物致病。感染引起的死亡率高达50％以上。目前检测阪崎肠杆菌的方法主要通过常规生化鉴定和PCR测定16SRNA。常规检测方法耗时较长，对检验员的要求较高，假阴性较高。PCR法检测费用昂贵，对仪器设备及检测环境的要求很高。血清学检测成本低廉，易于操作。研究血清学检测方法不仅可以辅助常规检测，还可以积极探索在临床诊断和流行病学调查中的应用。利用阪崎肠杆菌多克隆抗体进行免疫检测研究可以辅助鉴定阪崎肠杆菌，在此基础上为阪崎肠杆菌血清学分型菌提供依据，为进一步深入了解该菌提供科学依据。本文对阪崎肠杆菌的检测方法进行了综述。

　　1  阪崎肠杆菌的常规检测技术
   
　　美国食品和药品管理局(FDA)的检测方法是国际检测阪崎肠杆菌的标准生化方法。此外，还有依据该菌生理生化特征的鉴定方法和PCR法检测及荧光PCR等分子检测方法。我国目前尚无该菌检测方法的国家标准，只有行业标准。该标准建立了阪崎肠杆菌改进的传统检测方法(经典方法)、普通PCR方法和荧光PCR方法(快速筛选方法)，其中改进的传统方法与FDA方法比较，检测结果一致，但效率大大提高，时间缩短1/3～1/2。

　　1.1  生理生化检测技术

　　1.1.1  传统生理生化检测技术  目前，阪崎肠杆菌的分离主要是依据FDA标准方法。具体操作：称333g样品(如婴儿配方奶粉)，分成3份即3×1，3×10，3×100g，分别稀释成1：10的溶液(用蒸馏水或者蛋白胨缓冲液稀释)，然后取10ml混合液到90ml肠杆菌增殖肉汤中进行增殖培养，直接取0.1ml增殖菌液涂布平板培养或者用0.01ml的划线培养或者取1ml的菌液倒平板培养，采用结晶紫中性红胆盐葡萄糖琼脂(violet red bile glucose agar，VRBGA)培养基在36℃过夜进行选择培养，再挑取5个可疑菌落到胰蛋白酶大豆琼脂(trypticasesoy agar，TSA)培养基上，25℃培养48～72h，挑取黄色菌落，用微量生化法试剂盒(法国梅里埃生物公司，API-20E)和氧化酶法进行鉴定。

　　1.1.2  特异性生理生化检测技术  Muyt jens等在培养基中加入4-硝基苯酚-α-D-吡喃葡萄糖苷，只有阪崎肠杆菌产生黄色菌落，并且发现阪崎肠杆菌没有磷酰胺酶活性，而阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae)、成团肠杆菌(Enterobacter agglomerates)、产气肠杆菌(Enterobacter aerogenes)在实验中磷酰胺酶阳性率分别为72％，89％，100％。可见α-葡萄糖苷酶和磷酰胺酶存在与否是阪崎肠杆菌与其他肠杆菌之间2个主要区别，并进一步指出利用该2种酶反应随机检测重复率分别达89％和81％。但是由于产生的4-硝基苯酚在琼脂上很容易扩散影响实验结果观察，因而存在一定的局限性。Irvrsen等在(TSA)上加入5-溴4-氯-3-吲哚-α-D-葡萄糖苷酸(XαGle)，α-葡萄糖苷酶的作用于XαGle只有阪崎肠杆菌产生蓝绿色菌落，这种鉴别方法比传统FDA方法快2d，敏感性达100％，特异性达87.2％。但这种鉴别方法产生假阳性较多，比对FDA方法假阴性，各有优缺点。Leuseher等发现，在TSA上加入4-甲基伞形花内酮-α-D葡萄糖苷酸(α-MUG)可以鉴别阪崎肠杆菌可疑菌落，可疑菌落在加有α-MUG的营养琼脂上产生黄色菌落，用紫外线照射发出荧光，而其他实验菌株可生成黄色菌落，但在紫外线下不发出荧光。2004年OhSW等利用α-葡萄糖苷酶作用于底物α-MUG产生黄色菌落的基础上，对培养条件如培养温度、氮源的种类和剂量以及选择性培养基种类进行优化，指出在胰蛋白胨含量达20g/L的胆盐琼脂上，37℃培养24h具有最佳检出率。
   
　　2005年OhSW等报道了一种新的调制婴儿配方奶中阪崎肠杆菌快速监测方法，即96孔板荧光最大或然数(MPN)法快速计数。该方法根据阪崎肠杆菌产生的α-葡萄糖苷酶能分解α-MUG(OK培养基)产生荧光，对添加该底物的肉汤进行荧光检测，通过96孔微孔板进行10管(MPN)法计数。分别采用传统平板法和微量MPN法对蛋白胨水(0.2％)和调制婴儿配方奶中的阪崎肠杆菌进行定量检测，结果发现，上述2种方法在检测不同样品时，其相关性存在高度一致性。故认为，与传统平板法比较，微量MPN法所需时间较短(<10 h)，更为经济适用，可应用于婴儿配方奶中阪崎肠杆菌数量的快速监测。2006年2月，国际标准化组织(ISO)和国际乳品联盟(IDF)联合公布了“乳和乳制品中阪崎肠杆菌的检测”方法，即ISO/TS 22964 IDF/RM210。该方法2步选择性培养的温度均为44℃，整个实验需5～6d。

　　1.2  分子检测技术  目前，美国DuPont Qualicon开发出一套检测阪崎肠杆菌程序系统(BAX(r))，并用于和FDA方法进行对照检测。随机扩增多态性DNA(Random Amplified Polymorpgic DNA，RAPD)、脉冲电场凝胶电泳(pulsed-field gel electrophoresis，PFGE)、染色体DNA分析、核糖核酸分型以及质粒分型等都已用于对阪崎肠杆菌分型研究。
   
　　Nazarowec-Write和Farber等用EcoRl对18株阪崎肠杆菌进行核糖核酸分型，发现18株有10种分型。1999年Nazarowee-White和Farber等用Xa11限制性核酸内切酶对18株阪崎肠杆菌基因组进行切割，通过PFGE进行分型分析。结果显示，每个菌株都有一个不同的带型。高旗利等运用16S和23 SrDNA的保守区作为通用引物对16S～23S rDNA间区序列(IRS)进行扩增和测序，通过比较阪崎肠杆菌与近源菌株之间16S～23S rDNA间区序列的基础上，从设计的11对引物中优化出一对检测阪崎肠杆菌的特异性引物，采用该引物对阪崎肠杆菌进行检测，灵敏度达2.2～5.4 cfu／100 g，并且该方法与FDA方法检测结果完全相符。2004年Iversen等利用16S rDNA的测序结果对126株经生化鉴定(API20E和ID32E；bioMerieux)为阪崎肠杆菌菌株进行系统发育分析，发现菌株都分成4个簇，并且每个簇都和标准菌株存在一定差异，16S rDNA调查结果显示，与标准菌株的差异分别为0.1％～1.2％，1.6％～1.9％，2.2％～2.5％，3.5％；再从不同簇中选出41株阪崎肠杆菌，对其hsp60的测序结果进行系统发育分析，结果显示，同样形成4个簇，并且与标准菌株的差异分别为1.6％～4％，9.6％～10.8％，4.8％，11.2％。表明该菌具有遗传多样性，并且分类的复杂性比目前认为的要大得多。此外还发现，这种方法与DNA-DNA杂交方法的鉴定结果不成线形关系，因而寻找一种更为稳定的检测实际样品中阪崎肠杆菌的分子分型检测技术显得很关键。2005年Seo和Brackett报道了针对阪崎肠杆菌局部大分子合成操纵子，即rpsU基因3′末端和primase(dnaG基因5′末端，设计引物和TaqMan探针的实时定量PCR检测方法。选择68株肠杆菌和55株非肠杆菌科细评估该试验的特异性。未经富集，经50个PCR循环，该方法能检测到磷酸盐缓冲液(PBS)和调制婴儿配方奶中100 cfu/ml的阪崎肠杆菌，经过增菌培养，可检测到婴儿配方粉中1.6 cfu／g的阪崎肠杆菌。该方法能特异性地鉴别阪崎肠杆菌和其他肠杆菌及非肠杆菌科细菌，无需平板接种和生化鉴定，能节省5 d。当前，对阪崎肠杆菌分子检测方法，很多学者在进行定量PCR反应时都加入了内参(internal amplification control或internalpostive control)，内参是在PCR反应体系内部与目的片段一起扩增的一段寡核苷酸，用以监测整个PCR反应体系。在诊断PCR方法中，内参主要有2种类型：竞争性和非竞争性。内参排除假阴性，使实验结果更加真实可靠，在食源性致病菌检验中的作用不容忽视。目前，许多国家已要求在诊断PCR中强制使用，而国内对内参的应用很少。

　　2  阪崎肠杆菌免疫检测技术研究
   
　　血清学检测成本低廉，易于操作，制备多克隆抗体可用于辅助常规生化检测，快速进行中毒诊断。我国国家标准面前仍然使用血清学鉴定的方法用于沙门菌、志贺菌的分型。血清学检测的缺点是易产生交叉反应，不适合作为独立的检测方法应用。

　　2.1  利用多克隆抗体的免疫检测研究  何萍等通过碳化二(EDC)法化学偶联成完全抗原(-mcKLH)免疫家兔；制备兔抗钙激活蛋白43(calcium activated protein43，Cap43)多克隆抗体；用斑点ELISA法检测抗体效价，经辛酸一硫酸铵法初步纯化抗体后，十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)电泳考马斯亮监检测其纯化后的。结果经免疫11周得到兔抗Cap43多克隆体，抗体效价为1：500。
   
　　王志祥等通过采用家兔背部两侧多点皮内基础注射，静脉加强注射，利用饱和硫酸铵(SAS)盐析和葡聚糖凝胶分析法制备与纯化单核增多性李斯特杆菌多克隆抗体，获得高、高滴度的多抗。以此作为检测李斯特杆菌(Listeria monocytogenes)的诊断试剂。
   
　　赵志晶等以大肠埃希菌O157：H7免疫新西兰大耳白免，获得了抗大肠埃希菌O157：H7的多克隆抗体，经提纯后效价可达1：10万以上。以兔抗血清抗体为捕获抗体，以单克隆抗体3A5为检测抗体，建立了双抗夹心ELISA法，该方法稳定性、重复性良好。对纯培养菌液，其检出限为103～104 cfu／ml，具有良好的敏感性。71株各类菌株的检测结果表明，该方法只与大肠埃希菌O157发生强烈的特异性反应，而不与其他菌株的抗原产生交叉反应。染菌样品经选择性增菌后进行双抗夹心ELISA方法检测，检出限可达0.1 cfu／g(或ml)食品，能够基本满足食品样品中大肠埃希菌O157的检测需要。
   
　　季永峰等通过克隆和表达金黄色葡萄球菌肠毒素B(SEB)基因，制备SEB的多克隆抗体，应用于金黄色葡萄球菌引起的食物中毒诊断。成功地克隆了822bpSEB基因，编码272个氨基酸，在大肠埃希菌E.coli BL21(DE3)株中表达了重组rSEB分离纯化的rSEB能够诱导小鼠产生抗体，不仅能与rSEB反应，并且能够与天然的SEB特异性反应。
   
　　利用多克隆抗体进行的免疫检测研究现已广泛地应用在病原微生物的快速检测，大大提高了检测的敏感性和特异性，应用酶联免疫技术制造的检测试剂盒及mini-Vidas(全自动荧光免疫分析仪)等产品，其优点是检测灵敏度高、速度快，可以在48 h内快速鉴定沙门菌、大肠埃希菌O157：H7、单核李斯特菌，空肠弯曲杆菌和葡萄球菌肠毒素等。

　　2.2  阪崎肠杆菌多克隆抗体研究的目的及意义  阪崎肠杆菌多克隆抗体研究可用于血清学检测该菌，辅助对该菌的生化鉴定。在此基础上可以为阪崎肠杆菌血清学分型提供依据，为进一步深入了解该菌提供科学依据。因为该菌感染引起的死亡率高达50％以上，主要是新生儿感染，目前治疗手段主要使用氨比西林和庆大霉素等抗生素，治疗效果不是很好。通过阪崎肠杆菌多克隆抗体的研究还可以进一步探讨针对该菌的抗体临床应用，开辟治疗阪崎氏肠杆菌感染的新途径。
   
　　阪崎肠杆菌感染具有发病急，致死率高等特点，同时该菌的自然来源非常广泛，并且目前对其致病机制还不是很清楚，虽然近年来生化检测技术在FDA方法的基础上取得了很大的进展，但该方法假阴性较高，仍然存在一些缺陷。所以，进一步研究该菌的快速、准确、灵敏的检测方法对食源性致病菌感染的控制、疾病的诊断和流行病学调查非常关键。

　　3  小结
   
　　阪崎肠杆菌引发的食品污染及中毒的事件早以引起世界各国的重视，国际上逐步建立了阪崎肠杆菌的常规生化等检测方法和临床治疗方法，我国也在逐步深入研究该菌的各种检测方法。本研究的最终目标就是探索简便易行的血清学检测方法，并建立快速的中毒诊断方法，深入了解阪崎肠杆菌血清学特性。随着研究的不断进展，不仅能够为乳品等食品企业、质检、卫生、环保等检测机构提供方便快捷的检测方法，同时也将为临床上治疗该菌引发的疾病提供新的治疗手段，保护易感个体，提升该菌所致疾病的医疗卫生水平。